Novel strategies for multiplexing and fluorescence lifetime imaging in single molecule localisation microscopy
Nouvelles stratégies de multiplexage et d'imagerie de la durée de vie de la fluorescence en microscopie de localisation de molécules uniques
Résumé
Super-resolution fluorescence microscopy is based on Single Molecule Localisation Microscopy (SMLM) with sensitivity of an individual emitter and the nanometric resolution.SMLM is central in unravelling molecular assemblies and molecular dynamics within acell. In this context multiplexing to label various types of bio-molecules simultaneouslyis still a challenge and is highly desirable. In this thesis fluorescence characteristics suchas flux and its lifetime are presented as novel techniques for demixing and to improveperformance of SMLM. Multiplexing and demixing is either based on a method of sequential acquisition of targeted fluorophores or with fluorophores having sufficiently differentspectra. These methods are cumbersome, noise-prone, requires expensive setups. In thefirst part of this thesis, a novel demixing strategy is presented based on fluorescence-fluxof a fluorophore. When factors such as illumination, collection efficiency and its localchemical environment are controlled, detected flux depends on the type of fluorophore,and can be used for distinguish different species and perform simultaneous demixing. Asthe technique is independent of emission spectra, technique can be applied to spectrallyoverlapping fluorophores, and can be implemented with standard SMLM system with noadditional hardware. This can enhance the efficiency of demixing in a conventional system.The second part of the thesis focuses on novel approaches to perform Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) based on the emitted flux. We propose new flux-basedstrategies that does not require pulsed laser, fast and expensive monodetectors. In thesaturation regime of a fluorophore, emitted flux depends on fluorescence lifetime. This canbe used to estimate lifetimes and for distinguish them. In the first configuration, a continuous wave laser gated in microsecond range is used that can saturate the fluorophore. Atsaturation detected flux depends on maximum number of fluorescence absorption-emissioncycles and hence on the fluorescence lifetime. The variation of the detected signal as a funasction of the excitation up to saturation enable us to retrieve the fluorescence lifetime.As a proof of concept, we discern two species of fluorophore beads with this configuration.The second configuration involves the use of a pulsed laser with an optical delay line tocontrol the time delay between two successive pulses. At saturation, due to anti-bunching,detected signal integrated over a given series of double pulses depends on the delay. Thefluorescence lifetime can be retrieved from signal acquisitions with a varying delay. Thetheory for this technique and the configuration of the setup are presented in the thesis.
La microscopie de fluorescence à super-résolution est basée sur une approche de microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) avec la sensibilité d’un émetteurindividuel et la résolution nanométrique. La SMLM joue un rôle central dans l’élucidation des assemblages moléculaires et de la dynamique moléculaire au sein d’une cellule.Dans ce contexte, le multiplexage pour marquer simultanément différents types de biomolécules reste un défi et est hautement souhaitable. Dans cette thèse, les caractéristiquesde fluorescence telles que le flux et sa durée de vie sont présentées comme de nouvellestechniques de démixage et d’amélioration des performances de SMLM. Le multiplexageet le démixage sont basés sur une méthode d’acquisition séquentielle de fluorophores ciblés ou avec des fluorophores ayant des spectres suffisamment différents. Ces méthodessont lourdes, sujettes au bruit, et nécessitent des installations coûteuses. Dans la premièrepartie de cette thèse, une nouvelle stratégie de démixage est présentée, basée sur le fluxde fluorescence d’un fluorophore. Lorsque des facteurs tels que l’illumination, l’efficacitéde la collecte et son environnement chimique local sont contrôlés, le flux détecté dépenddu type de fluorophore, et peut être utilisé pour distinguer différentes espèces et effectuerun démixage simultané. Comme la technique est indépendante des spectres d’émission,elle peut être appliquée à des fluorophores dont les spectres se chevauchent, et peut êtremise en œuvre avec un système SMLM standard sans matériel supplémentaire. Cela peutaméliorer l’efficacité du démixage dans un système conventionnel. La deuxième partie dela thèse se concentre sur de nouvelles approches pour réaliser l’imagerie de la durée devie de la fluorescence (FLIM) basée sur le flux émis. Nous proposons de nouvelles stratégies basées sur le flux qui ne nécessitent pas de laser pulsé, de monodétecteurs rapides etcoûteux. Dans le régime de saturation d’un fluorophore, le flux émis dépend de la duréede vie de la fluorescence. Ceci peut être utilisé pour estimer les durées de vie et pour lesdistinguer. Dans la première configuration, on utilise un laser à onde continue déclenchéà la microseconde qui peut saturer le fluorophore. À la saturation, le flux détecté dépenddu nombre maximal de cycles d’absorption-émission de fluorescence et donc de la duréede vie de la fluorescence. La variation du signal détecté en fonction de l’excitation jusqu’àla saturation nous permet de retrouver la durée de vie de la fluorescence. Comme preuvede concept, nous discernons deux espèces de billes de fluorophore avec cette configuration.La deuxième configuration implique l’utilisation d’un laser pulsé avec une ligne à retardoptique pour contrôler le délai entre deux impulsions successives. A saturation, en raisonde l’anti-bunching, le signal détecté intégré sur une série donnée de doubles impulsionsdépend du retard. La durée de vie de la fluorescence peut être récupérée à partir d’acquisitions de signaux avec un retard variable. La théorie de cette technique et la configurationdu montage sont présentées dans la thèse.
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